Hija de Juan II e Isabel de Portugal. Nació en Madrigal de las Altas Torres (1451). Pasó su infancia en Arévalo. Su hermano Alfonso también era hijo de este matrimonio. A Juan II le sucedió en el trono Enrique IV, hijo que tuvo con su primera mujer; por tanto, hermanastro de Isabel. Enrique nombró heredera a su hija Juana la Beltraneja, pero algunos nobles castellanos no lo aceptaron porque pensaban que era hija ilegítima, y acordó con Isabel que ella le sucedería en el trono, pues el príncipe Alfonso había muerto. Isabel se casó con Fernando de Aragón. Tras la muerte de Enrique, Isabel fue proclamada reina. Pero el rey de Portugal se casó con la Beltraneja y reclamó sus derechos al trono. Estalló la guerra civil por la sucesión. Al final ganó el bando isabelino. Tuvo cinco hijos: Isabel, Juan, Juana (se casó con Felipe el Hermoso y fue la heredera), Catalina y María. Murió en Medina del Campo (1504).